MLPA Tekniği Nedir?

MLPA (Multiplex Ligasyona Bağlı Prob Amplifikasyonu), genomik DNA veya RNA dizisindeki “Normal Olmayan Kopya Sayısı” nın tespitini sağlayan bir “Multiplex” PCR yöntemidir. Hastalıkla ilişkili gen kopya sayısı varyasyonlarını (CNV) incelemek için kullanılan bir tekniktir. Tekniğin gücü çok yönlülüğüne dayanmaktadır. MLPA ayrıca DNA metilasyon değişikliklerini (MS-MLPA) tespit etmek için kullanılır ve hastalığa neden olan genlerde oldukça benzer psödogenlerden sapmaları ayırt edecek kadar hassastır. MLPA kromozomdan ekzona kadar tüm kopya sayısı değişikliklerini tespit etmede kullanılabilir.

Bu teknik, ilk kez 2002 yılında kullanılmıştır. MLPA çalışması için sadece bir thermal cycler ve kapiler elektroforez cihazı yeterlidir. Aynı anda 96 kadar numuneyi, 24 saat içinde sonuç alacak şekilde tabi tutmak mümkündür. MLPA, kopya sayısı belirlenmesi konusunda diğer tekniklere karşın daha hassastır. İyi karakterize edilmiş delesyon ve amplifikasyonlar PCR ile belirlenebilse de çoğunlukla delesyonların tam kırılma noktaları bilinememektedir. FISH yöntemi ile tespiti mümkün olmayan sık tek gen değişikliklerinin 50-70 nükleotid gibi kısa dizilerin belirlenmesinde oldukça avantaj sağlamaktadır. Bu yüzden oldukça fazla tercih edilmekte ve kullanılmaktadır. 45 farklı dizilimi hedefleyen MLPA reaksiyonu için sadece 20 nanogram DNA yeterlidir. Bu teknolojinin, uygulamalarında oldukça çok yönlü olması, hedef lokuslarında şekillendirilebilir olması, yüksek düzeyde otomatik olması, yüksek verimli testlere uygun olması, yetkin ve uygun maliyetli olması bakımından önemli avantajları vardır.

Zhengzhou Üniversitesi’nde MLPA tekniği kullanılarak yapılan bir çalışmada akraba olmayan 1051 Duchenne ve Becherin kas distrofisine sahip bireylerin genetik analizi yapılmıştır.

Çalışmada  MLPA analizi ile DMD geninin silinip silinmediğini veya kopyalanıp kopyalanmadığını belirlenmiştir. Sonuçlar, NGS ile ayrıca analiz edilmiş ve Sanger sıralaması ile doğrulanmıştır.

1051 vaka arasından 1029 vakada %97,91 (1029/1051) tespit oranıyla DMD gen mutasyonları gözlenmiştir. Büyük silmeler ve yinelemeler sırasıyla %70,41 (740/1051) ve %8,28’dir (87/1051). Kalan 201 hastadan 205’inde DNA dizilimi ile küçük mutasyonların olduğu belirtilmiştir.

MLPA Tekniğinin Aşamaları: 

1.DNA denatüre edilir.

2.MLPA prob karışım ile bir gün inkübasyon yapılır.

3.İki prob komşu dizilere tamamen hibridize olur.

4.Ligasyon aşamasında sadece komşu hedeflere hibridize olmuş iki probun bağlanması gerçekleşir.

5.PCR reaksiyonu sırasında sadece bağlı problar çoğaldığından, prob bağlı ürünün sayısı örnekteki hedef dizi sayısı için ölçü teşkil eder.

6.Kapiler elektroforez kullanılarak çoğaltılan ürünler ayrıştırılır.

7.Bağlanmamış prob oligonükleotidler, bir primer dizisi içerirler.

8.Sonuç olarak bunlar eksponansiyel olarak çoğaltılmaz ve bir işaret de üretmezler.

9.MLPA yönteminde bu yüzden, bağlanmamış probların bertarafı gereksizdir ve bu da yöntemin uygulanmasını kolaylaştırır.

MLPA Tekniğinin Kullanım Alanları 

• Mutasyon analizleri
• Tek nükleotid polimorfizmi
• DNA metilasyon analizi
• mRNA konsantrasyonu
• Hücre hatlarının ve dokularının kromozom analizleri
• Gen kopya sayısının analizleri
• Kanser genlerindeki duplikasyon ve delesyonların tespiti
• Anöploidi tespiti
• Prenetal teşhis vb. alanlarda bu teknik kullanılabilir.