PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), esas itibariyle deney tüpünde gerçekleşen DNA replikasyonudur. PCR’da DNA parçaları bir deney tüpünde amplifikasyon (çoğaltım) adı verilen bir işlemle milyarlarca kez kopyalanabilir. Böylece spesifik bir genin veya DNA segmentinin moleküler biyolojide değişik amaçlar için kullanılabilecek yeterli miktarı elde edilir. PCR işleminde doğada da DNA’yı kopyalayabilen DNA polimeraz enzimleri kullanılır. Bu işlemde DNA sentezini başlatmak için sentetik olarak sentezlenmiş oligonükleotid primerleri kullanılır ancak bunlar DNA’dan yapılmıştır (halbuki hücrede primerler RNA’dan yapılmıştır). PCR’da aslında bütün DNA molekülü kopyalanmaz, onun yerine DNA molekülünün (kalıp DNA) birkaç bin bazlık bir kısmı (hedef DNA) çoğaltılır.

DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isim olarak tanımlanmaktadır. PCR bir tanı testi olarak bilinmektedir ve koronavirüste de virüse ait RNA’yı göstermektedir. Yani PCR test koronavirüs sürecinde, vücuttaki virüsün kimliğini göstermek için yapılan bir testtir. Farklı hastalıklar için de kullanılan PCR, vücuttaki çok az sayıdaki mikrobu bile tespit edebilmektedir. PCR testine moleküler tanı testi de denebilmektedir. Test, vücutta virüsün varlığını, ayrıca vücudun enfeksiyona yanıt olarak ürettiği antikorları belirleyebilmektedir.

PCR testlerinde, burun ve boğazdan ucu pamuklu ince bir çubuk vasıtasıyla sürüntü örneği alınmaktadır. Bunun yanında öksürdükten sonra çıkan balgam da örnek olarak alınabilmektedir.

Biyologlar tarafından alınan örnek özel bir kaba konulmaktadır ve bu örnek laboratuvarda test kartuşuna aktarılır. Bu aşamadan sonra örnek otomatik olarak filtre edilir. Daha sonra ultrasonik dalgalarla virüsün DNA’sı salınır. Bu aşamada PCR ajanlarıyla DNA molekülleri karışır. Sonrasında reaksiyon tüpünde gerçek zamanlı çoğalma ve tanımlama yapılır. Ve sonrasında da sonuç aşamasına gelinir.

1. Kalıp DNA ısıtılarak denatüre edilir : PCR; 94°C-98 °C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon yani yüksek ısıya maruz kalan DNA’nın iki zincirinin ayrılması
2. Primerler eklenir : 37 °C-65 °C aralığında gerçekleştirilen tavlama yani sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanması (hibridizasyon)
3. Zincir uzatılır : 72 °C’de DNA polimeraz orjinal DNA’yı kalıp olarak kullanarak primerleri uzatması
4. Uygun bir inkübasyon periyodundan sonra zincirleri ayırmak için PCR karışımı tekrar ısıtılır ancak şimdi hedef DNA orjinal miktarının 2 katı olarak bulunur. Daha sonra, primerlerin yeni sentezlenmiş DNA’lardaki tamamlayıcı bölgelere hibridize olması için PCR karışımı soğutulur ve tüm işlem tekrarlanarak devam edilir.

Deney tüplerinde çift zincir DNA kopyalarını denatüre etmek için yüksek ısı kullanıldığından dolayı, sıcak kaplıcalardan izole edilen termofilik bir bakteri olan Thermus aquaitus dan izole edilen ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz kullanılır. Taq polimeraz olarak adlandırılan bu enzim 95°C ısıya dayandığından PCR basamaklarında uygulanan denatürasyon aşamalarından etkilenmezler. Optimum büyüme sıcaklığı 100°C olan hipertermofil Pyrococcus furiosus  bakterisinden elde edilen ve Pfu polimeraz adı verilen enzim Taq polimerazdan bile daha yüksek ısıya dayanıklıdır. Ayrıca Taq polimerazdan farklı olarak Pfu polimeraz düzeltme aktivitesine de sahip olduğundan yüksek doğruluk gerektiren çalışmalarda özellikle tercih edilir. Isıya dirençli DNA polimeraz ihtiyacını karşılamak için bu enzimleri kodlayan genler Escherichia coli bakterisine klonlanmış ve böylece yüksek miktarda enzim sentezi mümkün olmuştur.

PCR’de kullanılan temel bileşenler :  Kalıp DNA (template), primerler, nükleotidler (dNTP), DNA Polimeraz Enzimi, Tampon çözelti (Buffer) ve Magnezyumdan (MgCl2 veya MgSO4) oluşmaktadır. Kullanılan bu temel bileşenlerin miktarı ve kalitesi reaksiyon sonucunu önemli ölçüde etkilemektedir. Temel bileşenlerin yanı sıra kullanılan Thermal Cycler, primer hatta mikrofüj tüpün bile sonucu etkilediği bilinmektedir (Anonim, 2005; Karcicio, 2007). Bu nedenle kullanılan bileşenlerin miktarı deneylerle optimize edilmeli ve kullanıcı optimum koşulları kendisi ayarlamalıdır. Optimizasyon yapılmadığı takdirde spesifik olmayan amplifikasyon (non spesifik), PCR ürününün zayıf olması, daha önce çalışan reaksiyonun çalışmaması ve beklenmedik ürünlerin ortaya çıkması gibi sorunlar ortaya çıkabilir. Herhangi bir bileşenin fazla ya da eksik konulması istenmedik ya da yanıltıcı sonuçların ortaya çıkmasına neden olabilir. Reaksiyon sonucunu etkileyen en önemli bileşenler kalıp DNA, primer, dNTP ve Magnezyumdur

PCR Çeşitleri

RT-PCR (Reverse transcription PCR) : Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR), kalıp RNA molekülünden DNA yapılmak için kullanılır. Bu PCR çeşidinde RNA’yı tamamlayıcı DNA’ya (cDNA) çevirmek için retroviral bir enzim olan revers transkriptaz kullanılır. Böylelikle kan, serum, hücre kültürleri, dokular ve bakteri kültürlerindeki test edilmek istenilen RNA tespit edilerek, miktarı için de analiz edilebilmektedir. RNA’yı kalıp olarak kullanılarak tek zincir cDNA yapma aşamaları;

• Primer ve revers transkriptazın eklenmesi
• Tek zincirli cDNA oluşturan ters transkripsiyon
• RNaz H eklenmesi (RNA’ları parçalar)
• 5′ ucuna spesifik primer ve Taq polimeraz eklenmesi

Real-Time PCR (qPCR) : DNA moleküllerinin, PCR ürünlerini gerçek zamanlı olarak izlemek ve ölçmek için kullanılan floresan boya kullanılarak etiketlendiği PCR çeşididir. Bu floresan sinyali, floresan işaretli proplar veya çift sarmallı DNA’ya bağlandığı zaman ışıma yapabilen boyalar sayesinde her yeni oluşan DNA parçasının kantitatif analizi reaksiyon sırasında yapılabilmektedir.

Multiplex PCR : Multipleks polimeraz zincir reaksiyonu, birkaç farklı DNA sekansını aynı anda amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonunun kullanımını ifade eder. Bu işlem, çoklu bir primer ve bir termal döngüleyicide sıcaklık aracılı bir DNA polimeraz kullanılarak numunelerdeki DNA’yı çoğaltır. Reaksiyondaki artan primer sayısı nedeniyle, uygun primer tasarımı, multipleks reaksiyonunuzun başarısı için kritik öneme sahiptir. Özel enzim formülasyonları, çoklu performansı artırabilir ve sorun giderme ihtiyacını azaltabilir.

Nested PCR : Duyarlılığı ve özgüllüğü geliştirmek için tasarlanmış bir PCR modifikasyonudur. Yuvalanmış (iç içe) polimeraz zincir reaksiyonu, beklenmedik primer bağlanma bölgelerinin amplifikasyonu nedeniyle ürünlerdeki spesifik olmayan bağlanmayı azaltmayı amaçlayan polimeraz zincir reaksiyonunun bir modifikasyonudur. Nested PCR, iki primer seti kullanır, birinci set, ilk amplifikasyon turu için doğrudan hedef sekansın dışında sekansları kuşatır. İkinci primer seti, birinci turdaki hedef sekansa spesifiktir ve daha sonra iç içe primerler kullanılarak ikinci tur PCR için şablon olarak kullanılır.

In situ PCR : In-situ, “orijinal yerinde” anlamına gelir. Biyoloji bağlamında bu, hücre, vücut veya doku anlamına gelir. In situ PCR, PCR’ın bir hücre içindeki doku bölümünde gerçekleştirildiği bir tekniktir. İlgili doku kesitleri mikroskobik bir slayta eklenir ve PCR için gerekli tüm reaktiflerle inkübe edilir. Hücrelerin içinde bulunan DNA, amplifikasyon için şablon sağlar, bu nedenle bu teknik, belirli bir genin yerini bulmak ve hangi dokuda hangi hücrelerin bulunduğu hakkında bilgi vermek için kullanışlıdır.

Hem DNA hem de mRNA hedeflerinin, dondurulmuş veya parafinle sabitlenmiş doku bölümleri, hücre kültürü veya diğer tek hücre süspansiyonlarından amplifikasyonu için kullanılan PCR çeşididir. Protokol:

• doku hazırlama
• in situ PCR (veya in situ RT-PCR)
• prob hibridizasyonu
• sinyal algılama

Teknik yüksek hassasiyete ve özgüllüğe (hedef genler için spesifik floresan veya biyotinile problar ile in situ hibridizasyondan türetilmiştir) sahiptir. Mikroskop altında bir doku bölümünde gizli bir biçimde özel ilgi konusu genleri ifade eden veya taşıyan tek tek hücreleri tanımlama yeteneği, sessiz genlerin görsel bir açıklamasını sağlar. Normal ve patolojik koşulların veya gizli veya aktif durumların çeşitli yönlerinin belirlenmesine izin verir. Tekniği uygulamak için ortalama 48 saat gereklidir.

Hot Start PCR : Taq polimerazı inaktive etmek için kullanılan ve antikorları denatüre etmek için ısının kullanıldığı PCR çeşididir. Hot Start PCR, bir ısı aktivasyon adımı meydana gelene kadar reaksiyon kurulumu sırasında Hot Start Taq polimeraz aktivitesini veya değiştirilmiş dNTP’lerin dahil edilmesini inhibe eden bir tekniktir. Hot Start PCR, spesifik olmayan amplifikasyon ve primer dimer oluşumu olmadan oda sıcaklığında reaksiyon kurulumuna izin verir. Oysa geleneksel PCR, ek bir sıcaklığa duyarlı reaksiyon aktivasyon bileşeni olmadan DNA hedef dizinizin üstel kopyalarını yapmak için sıklıkla kullanılır.

Long-range PCR : Tipik olarak rutin PCR yöntemleri veya reaktifleri kullanılarak amplifiye edilemeyen, uzunluğu 5 kb’nin üzerindeki DNA hedeflerinin amplifikasyonunu ifade eder. Geleneksel olarak, long range PCR, az miktarda düzeltici polimeraz (doğruluk için) ile birleştirilmiş bir Taq DNA polimeraz karışımı (hızlı uzama için) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Düzeltme enzimi, büyüyen sarmalın 3 ‘ucunda bulunan DNA uyumsuzluklarını onararak, Taq polimerazın DNA’yı normalde olduğundan çok daha fazla uzatmasına izin vererek daha uzun DNA amplifikasyonu sağlar. Aynı zamanda, gelişmiş DNA bağlanması ile modifiye edilmiş yüksek bağlılık özelliği gösteren polimerazlar kullanılarak elde edilebilir, bu da uzun fragmanların oldukça işlemsel ve doğru amplifikasyonuyla sonuçlanır. Klonlama, genom haritalama veya dizileme için olsun, PCR Biosystems hızlı ve yüksek doğrulukta uzun fragmanların amplifikasyonunu sağlayan bir dizi çözüm sunar.

Assembly PCR : Polimeraz döngü takımı, daha kısa fragmanlardan büyük DNA oligonükleotitlerin montajı için bir yöntemdir. Assembly PCR, füzyon genlerinin / parçalarının daha kolay klonlanması için iki gen boyutlu DNA parçasını tek parça halinde birleştirmek için kullanılabilir. Kısaca, esasen iki parçanın 20bp’lik bir örtüşmeye sahip primerlerle ayrı ayrı PCR’lanmasını ve ardından şablon olarak iki ürünü kullanarak fazladan bir PCR adımı yapılmasını içerir. Bu aslında sadece klonlama kolaylığı içindir.

Asymmetric PCR : Asimetrik PCR, orijinal DNA’nın bir sarmalını diğerinden daha fazla tercihen amplifiye etmek için kullanılan bir PCR varyasyonudur. Tekniğin, iki tamamlayıcı diziden sadece birine sahip olmanın gerekli olduğu bazı sekanslama ve hibridizasyon problama türlerinde uygulamaları vardır.

Hot Start PCR, Nested PCR ve Multiplex PCR karşılaştırması

Hot Start PCR’nin faydaları arasında, spesifik olmayan amplifikasyon olmadan uygun oda sıcaklığı kurulumu ve her ikisi de hedef sekans spesifikliğini ve toplam verimi azaltabilen primer-dimerlerin oluşumu yer alır. Nested PCR veya multipleks PCR gibi alternatif PCR yöntemleri, bir veya daha fazla amplikon için özgünlük ve yüksek verim elde etmek için farklı reaktifler ve stratejiler kullanır.  Nested PCR, iki primer seti kullanır, birinci set, ilk amplifikasyon turu için doğrudan hedef sekansın dışında sekansları kuşatır. İkinci primer seti, birinci turdaki hedef sekansa spesifiktir ve daha sonra iç içe primerler kullanılarak ikinci tur PCR için şablon olarak kullanılır. Multiplex PCR, aynı reaksiyon sırasında birden fazla hedef diziyi eşzamanlı olarak çoğaltmak için çok sayıda yüksek spesifik primer seti kullanır.